轉錄組重測序

轉錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有mRNA的總和。轉錄組研究是基因功能及基因結構等研究的基礎，通過新一代高通量測序，能夠快速的獲得某一物種特定組織或在某一狀態下的幾乎所有轉錄本序列信息，已廣泛應用于臨床診斷、基礎研究和研發等領域。將含有靶基因mRNA同源互補序列的RNA（DoublestrandRNA，dsRNA）導入細胞后，能夠特異地識別該mRNA，引起mRNA的降解，從而導致相應的功能缺失。

轉錄組Resequencing針對的是有參考基因組的物種。用新一代高通量測序技術對某物種的特定組織或細胞進行轉錄組測序，與參考基因組比較，可以得到基因表達差異、可變剪接、融合基因等遺傳調控信息。

分子與質粒載體構建

實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧定全部轉化為胸腺嘧定，zui后對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生jia基化，稱為BSP-直接測序法。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應分為3步：，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復合物；然后，酶—AMP復合物再結合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。

DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛堿性磷酸酶)CIP處理克服。

連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。

5.長可以合成多長的引物？

答：引物越長，出現問題的概率就越大。有的公司合成過120base的引物，產率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗產品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過40%，后續處理還有丟失很多，的產量很低。PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100ul進行抽提反應混合液,以除去石蠟油。

6.需要合成多少OD數？

答：根據實驗目的確定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數。從單個的生物體到qi官到組織到細胞，再從細胞結構到核酸和蛋白的分子水平，人們意識到可以通過檢測分子水平的線性結構（如核酸序列），來橫向比較不同物種，同物種不同個體，同個體不同細胞或不同生理（病理）狀態的差異。片段越長, 全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數要求，其實也是對社會資源的一種浪費，同時也從一個側面反映了部分研究人員特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復多次才能成功。

16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？

答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到，產生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能保證擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能保證正確。要知道，引物合成中發生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。線粒體的組成可以從兩個層面上反映物種及群體的遺傳和進化，即核酸序列組成和基因組的結構特征，兩者的特征具有不同的進化機制和進化速度，在進化生物學研究中可以很好的互補。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

17.如果測序發現突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯系，生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數據。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下，建議重新挑取測序，可能會找到正確的。根據經驗，40個堿基以下的引物，測1-2個就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。乳糖發酵試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發酵管。基因拼接過程中，如果發現一段區域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。