分子實(shí)驗(yàn)介紹——熒光檢測(cè)
細(xì)胞熒光染色是以熒光物質(zhì)標(biāo)記而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)。在細(xì)胞中，通過特定的標(biāo)記，可以檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量和表達(dá)定位。是細(xì)胞中的可直觀觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白定位和表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法。
實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞固定-細(xì)胞膜破膜-蛋白封閉-目的蛋白結(jié)合-熒光二抗結(jié)合-DAPI染色-熒光顯微鏡拍照或激光共聚焦顯微鏡拍照。
結(jié)果示例：
細(xì)胞熒光染
通過觀察細(xì)胞中蛋白的熒光強(qiáng)度和定位分析該蛋白的表達(dá)變化。
免yi共沉淀（Co-IP檢測(cè)）是以抗ti和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4°C待電泳檢測(cè)或-20°C長(zhǎng)期保存。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用也被保留下來(lái)。用預(yù)先固化在beads上的蛋白質(zhì)A的抗ti免yi沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來(lái)，再通過蛋白變性分離，對(duì)B蛋白進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。
單細(xì)胞RNA測(cè)序
單細(xì)胞RNA測(cè)序也稱scRNA-Seq。其基礎(chǔ)是在強(qiáng)電場(chǎng)下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結(jié)構(gòu)以及疏水性等不同而相互分開。通常而言，一般的組織細(xì)胞RNA-seq實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生1000萬(wàn)個(gè)讀數(shù)，如果一個(gè)基因的頻率超過50RPKM，即每百萬(wàn)讀數(shù)中每千個(gè)堿基中超過50個(gè)，這一基因即被認(rèn)為有表達(dá)。泊松分布下，1kb長(zhǎng)的基因有超過500個(gè)讀數(shù)和4%的小變異系數(shù)，即CV值；哺乳動(dòng)物細(xì)胞通產(chǎn)含有200,000個(gè)mRNA，因此至少要用50個(gè)單細(xì)胞一起才能到達(dá)小CV值；考慮到逆轉(zhuǎn)錄的效率和環(huán)境干擾等因素，為得到準(zhǔn)確的表達(dá)和細(xì)胞種類的識(shí)別，需要使用的細(xì)胞數(shù)量實(shí)際要更多。
18.引物是經(jīng)過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？
答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個(gè)堿基的差別。lncRNA和mRNA同時(shí)檢測(cè)：芯片上包含有的lncRNA和新的mRNA序列檢測(cè)探針。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，很難說不割到差別僅幾個(gè)堿基的引物。國(guó)內(nèi)有一個(gè)不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長(zhǎng)引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時(shí)可能比較寬。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問題可能就會(huì)少一些。
19. TaqMan 探針設(shè)計(jì)的基本原則是什么？
答：下列原則供您參考。
◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。
◆長(zhǎng)度一般為18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。
◆在引物的5'端避免使用G。
◆選用比較多的堿基C。
◆退火溫度Tm控制在 68-70C 左右。
有用的熒光染料參數(shù)