分子實驗介紹——熒光檢測

細胞熒光染色是以熒光物質標記而進行抗原定位的技術。在細胞中，通過特定的標記，可以檢測目的蛋白表達量和表達定位。是細胞中的可直觀觀察細胞內蛋白定位和表達的實驗方法。

實驗流程：細胞固定-細胞膜破膜-蛋白封閉-目的蛋白結合-熒光二抗結合-DAPI染色-熒光顯微鏡拍照或激光共聚焦顯微鏡拍照。

結果示例：

細胞熒光染

通過觀察細胞中蛋白的熒光強度和定位分析該蛋白的表達變化。

二、大腸菌群檢驗方法:

由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。 目前國內采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有和原國家商檢局制訂的行業標準。2009年，外顯子組捕獲工具的出現，讓外顯子組測序這種技術迅速紅起來。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。

(一):采用三步法，即:乳糖發酵試驗、分離培養和證實試驗。乳糖發酵試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發酵管。36士1C培養48土2h，觀察是否產氣。分離培養:將產氣發酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36士1°C培養18-24h，觀察菌落形態。證實試驗:挑取平板上的菌落，進行革蘭氏染色觀察。當重組病毒載體導入包裝細胞后，缺陷病毒載體和包裝細胞的互補作用共同完成病毒裝配，該病毒顆粒可其它宿主細胞，此時目的基因進入該細胞并整合到細胞基因組中，導致插入序列在宿主細胞中表達，產生目的蛋白。同時接種乳糖發酵管36士1°C培養24土2h,觀察產氣情況。

報告:

根據證實為大腸陽性的管數，查MPN表，報告每100ml ( g)大腸菌群的MPN值。具體操作參見GB4789. 3-94 《中華人民共和國食品衛生微生物學檢驗大腸菌群測定》

(二)原國家商檢局制訂的行業標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸進行檢測。本方法采用兩步法：推測試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36士1C培養48士2h，觀察是否產氣。證實試驗:將產氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36士1°C培養48士2h，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性。基因組甲l基化水平(MethylationContent)的分析:1。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。具體操作參見SN0169-92《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸檢驗方法》

二、使用說明

1、裝載探針

對于刺激時間較短（通常為2小時以內）的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照及自己感興趣的刺激細胞。對于細胞刺激

時間較長（通常為6小時以上）的細胞，先用活性氧陽性對照及自己感興趣的刺激細胞，后裝載探針。

原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養細胞。按照1：1000用無培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA的體積為1毫升。37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。具體操作參見SN0169-92《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸檢驗方法》。用無細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

3、參數設置

使用488nm激發波長，525nm發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數設置檢測DCF。DCF的激發光譜和發射光譜參考下圖。

4、其它說明

陽性對照可以按照1：1000的比例使用。例如裝載好探針的細胞共1毫升，可以加入1微升的陽性對照刺激。通常刺激后20-30分鐘內可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內觀察不到活性氧的升高，可以適當提高活性氧陽性對照的濃度。針對預測的靶蛋白結合RNA的序列設計引物，做qPCR實驗，驗證預測的RNA是否與靶蛋白有結合，或者將分離出來的RNA做高通量測序，篩選到可能與靶蛋白結合的RNA。如果活性氧升高得過快，可以適當降低活性氧陽性對照的濃度。

另外，對于某些細胞，如果發現沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1：2000-1：5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA的濃度為2-5微摩爾/升。探針裝載的時間也可以根據情況在15-60分鐘內適當進行調整。