外顯子測序

外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現，讓外顯子組測序這種技術迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個外顯子組被測序。

如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏NimbleGen、安捷倫、Illumina，還有現在的華大基因。這些方法究竟孰優孰劣，斯坦福大學醫學院遺傳學系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進行了比較。該研究結果發表在《Nature Biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、Illumina和NimbleGen的外顯子組測序平臺對同一個人類血液樣品進行分析。他們的結 果表明，NimbleGen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺，盡管覆蓋了較少的基因組區域，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。在同樣獲得80M測序數據的情況下，NimbleGen有97%的目標序列達到10x以上的測序深度，而其他產品只有90%。而安捷倫和Illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數量的變異。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。若miRNA與mRNA的結合位點不配對，則抑制mRNA的翻譯。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序（WGS），顯示外顯子組測序能夠檢測到WGS錯過的小變異。

除了文中提到了三個主流平臺，外顯子組捕獲方面的新產品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏NimbleGen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產品。這一新產品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產品相同的2.1M高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。MiRNA是一類可以通過RNAi機制調節基因表達的內源性小RNA，人工miRNA與shRNA的設計原理基本相同，由于miRNA具有內源性，因此其更易產生有效的基因沉默。

二、使用說明

1、裝載探針

對于刺激時間較短（通常為2小時以內）的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照及自己感興趣的刺激細胞。對于細胞刺激

時間較長（通常為6小時以上）的細胞，先用活性氧陽性對照及自己感興趣的刺激細胞，后裝載探針。

原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養細胞。按照1：1000用無培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA的體積為1毫升。37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。分離培養:將產氣發酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36士1°C培養18-24h，觀察菌落形態。用無細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？

答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到，產生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能保證擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能保證正確。要知道，引物合成中發生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。逆轉錄病毒載體在外源基因表達、基因沉默、、生物制藥等得到廣泛的應用。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

17.如果測序發現突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯系，生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數據。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下，建議重新挑取測序，可能會找到正確的。根據經驗，40個堿基以下的引物，測1-2個就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發現一段區域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。由于應用各種性質的微粒填料和加壓的液體流動相，本法具有分離性能高，分析速度快的特點。