分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測
熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。這些方法究竟孰優孰劣，斯坦福大學醫學院遺傳學系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進行了比較。Sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多。
SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結合時，發出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。分子生物學檢測技術是現代分子生物學與分子遺傳學取得進步的結晶，是在人們對基因的結構以及基因的表達和調控等生命本質問題的認識日益加深的基礎上產生的。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。
實驗流程：細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉錄-定量PCR檢測。
結果示例：
圖 A 基因擴增曲線圖；B 基因擴增溶解曲線圖；C mRNA相對表達量變化
從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果，溶解曲線可以看出引物識別特異性情況，通過使用ΔΔCt方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。
逆轉錄病毒構建及包裝
逆轉錄病毒（Retrovirus）是一類RNA病毒。在逆轉錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA再通過DNA、轉錄、翻譯等過程形成病毒顆粒。逆轉錄病毒表達系統是一種新的重組蛋白表達系統，由逆轉錄病毒載體、輔助載體（表達病毒包裝需要的蛋白質）和包裝細胞系組成。逆轉錄病毒載體在外源基因表達、基因沉默、、生物制藥等得到廣泛的應用。外顯子測序外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進行拷問。逆轉錄病毒載體主要優點：轉染范圍廣，可以各種細胞類型，轉入的外源基因可完全融合，對細胞率高，細胞不產生病變，可建立細胞系長期持續表達外源基因。
逆轉錄病毒載體系統共有兩部分組成：包裝細胞系和缺陷病毒本身。在逆轉錄病毒載體中，去除了正常的蛋白編碼序列而保留了和包裝信號，通過分子技術將目的基因插入此載體上，而包裝細胞系能提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結構蛋白。當重組病毒載體導入包裝細胞后，缺陷病毒載體和包裝細胞的互補作用共同完成病毒裝配，該病毒顆?？善渌拗骷毎?，此時目的基因進入該細胞并整合到細胞基因組中，導致插入序列在宿主細胞中表達，產生目的蛋白。將含有靶基因mRNA同源互補序列的RNA（DoublestrandRNA，dsRNA）導入細胞后，能夠特異地識別該mRNA，引起mRNA的降解，從而導致相應的功能缺失。宿主細胞不能像包裝細胞那樣為缺失結構基因的逆轉錄病毒提供結構蛋白，因而在宿主細胞內不會產生新的毒顆粒，保證了該載體在生物制品領域的生物安全性問題。
凝膠阻滯遷移電泳檢測服務（EMSA）
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一種研究DNA/RNA結合蛋白和其相關的DNA/RNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。依據實驗需要，設計標記探針、非標記探針、蛋白特異性抗ti等參照物，基于DNA-蛋白質或RNA-蛋白質復合體在聚bing烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理，當轉錄因子與特異的DNA或RNA結合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結合核蛋白轉錄因子的DNA，從而檢測到活化的與DNA或RNA結合的蛋白轉錄或調節因子。以zui小點面積30，平滑度2為主要參數zui大限度檢測蛋白質點。