干細bao培養誘導分化

干細bao是一類具有自我更新、高度增殖和多項分化潛能的細胞，理論上具有分裂能力，在特定條件下，可分化成特定組織。通常改變抑制 ES 細胞不分化狀態的培養條件, ES 細胞就可以分化成多種細胞類型。ES 細胞具有的這種能力在體外增殖并保持未分化狀態及其多向分化潛能的生物學特性,使其廣泛應用于生物學研究的各個領域, 它的潛在醫學應用價值已成為世界范圍內研究的熱點。目前，已報道的自ES細胞誘導分化的細胞主要包括胰島細胞、造血細胞、肝細胞、神經細胞、脂肪細胞、心肌細胞、內皮細胞、上皮細胞、成骨細胞、軟gu細胞和黑素細胞等。9(MMP-9)、TRAP和組織蛋白酶K(CathepsinK)的表達進行檢測結果共培養5天后可觀TRAP(+)多核細胞形成13天TRAP(+)多核細胞數目達到高峰。

平板克l隆形成實驗基本步驟::

1、取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛的DMEM培養液中備用。

2、將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200 個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37團5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2~3周。

3、經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個細胞的數。后計算形成率。形成率= (數/接種細胞數) x平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。透射電鏡觀察自噬小體方法利用光學顯微鏡，借助相應的染色方法，可以觀察細胞凋亡時會出現的一系列形態特征。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞- -定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。

目的

學習和掌握外源基因導入真核細胞的主要方法——脂質體介導的轉染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準備實驗材料。

實驗原理

上圖所示是脂質體介導轉染的示意圖，它顯示了外源質粒進入細胞的一般過程。

外源基因進入細胞主要有四種方法：法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒細胞的方法使得其進入細胞。但是由于法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會凝固。病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。

利用脂質體轉染法重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。