——{微生物檢測}常規鑒定技術二——

(二)生理生化試驗

微生物生化反應：指用化學反應來測定微生物的代謝產物，生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一。

微生物檢驗中常用的生化反應有：

1、糖酵解試驗

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。

2、淀粉水解試驗

某些細菌可以產生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。

3、v-p試驗

某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酸，丙酸縮合，脫羧成乙酰，后者在強堿環境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱v－p(+)反應。

4.供試品中微生物的回收

微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。

（1）平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗菌每種培養基至少制備2個平皿，以算術均值作為計數結果。

傾注法 取照上述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗jun活性的去除或滅活” 制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。在厭氧微生物的培養過程中，zui重要的一點就是要除去培養基中的氧氣。若使用直徑較大的平皿，培養基的用量應相應增加。按表1規定條件培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。計算各試驗組的平均菌落數。

涂布法 取15～20ml溫度不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，注入直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養基表面干燥。30-2010食品安全標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗GB4789。若使用直徑較大的平皿，培養基用量也應相應增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備” “接種和稀釋” 和“抗jun活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規定條件培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。計算各試驗組的平均菌落數。

菌落總數測定注意事項

1.選取樣品要有代表性，如為固體樣品要多采幾個部位，液體檢樣要混勻。

2.每次做樣從開始到結束都要進行超凈臺空氣凈度的監測，同時對所有滅菌物品做空白對照。

3.為減少稀釋倍數的誤差，在做連續遞增稀釋時，每一稀釋液應充分振搖使其均勻，同時每一稀釋度換一支吸管。

4.在進行連續稀釋時，應將吸管內液體沿壁流入，勿使吸管觸及稀釋液。

5.傾倒營養瓊脂培養基平板時，溫度要在46±1℃之間，數量要在15ml左右為宜，不要太多太少。

6.培養物48h培養后培養基失重不超過15%，培養箱內要放水。

7.樣加入平皿后應立即傾注培養基并旋轉混勻，一般從稀釋到傾注不超過20分鐘。

8.平皿內如有鏈狀菌落生長時：菌落之間無明顯界限且僅有一條鏈可視為一個菌落，如為不同來源的幾條鏈則將每條鏈各做一個菌落記。

9.做菌落記數時平板里所有的菌落都要記數。

微生物限度檢查法

1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法

1106非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法

1107非無菌藥品微生物限度標準

1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法

計數方法

……供試品檢查時，應根據供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數方法，檢測的樣品量應能保證所獲得的試驗結果能夠判斷供試品是否符合規定。所選方法的適用性須經確認。

提示：后文增加了對于“貴重藥品、微量包裝藥品”的檢驗量的更的表述，因注意結合此處的要求。

計數培養基適用性檢查和供試品計數方法適用性試驗

……菌液制備……取黑曲霉的新鮮培養物加人適量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或……

學習：此處改動同無菌檢查法，將“3~5ml”的具體量調整為“適量”，便于根據孢子的量靈活掌握菌液制備方法。