——{微生物檢測}常規(guī)鑒定技術(shù)二——

(二)生理生化試驗(yàn)

微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。

微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：

1、糖酵解試驗(yàn)

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn)。

2、淀粉水解試驗(yàn)

某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。

3、v-p試驗(yàn)

某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酸，丙酸縮合，脫羧成乙酰，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱v－p(+)反應(yīng)。

4.供試品中微生物的回收

微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。

（1）平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。

傾注法 取照上述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗jun活性的去除或滅活” 制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，zui重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

涂布法 取15～20ml溫度不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。30-2010食品安全標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)GB4789。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備” “接種和稀釋” 和“抗jun活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

菌落總數(shù)測定注意事項(xiàng)

1.選取樣品要有代表性，如為固體樣品要多采幾個(gè)部位，液體檢樣要混勻。

2.每次做樣從開始到結(jié)束都要進(jìn)行超凈臺空氣凈度的監(jiān)測，同時(shí)對所有滅菌物品做空白對照。

3.為減少稀釋倍數(shù)的誤差，在做連續(xù)遞增稀釋時(shí)，每一稀釋液應(yīng)充分振搖使其均勻，同時(shí)每一稀釋度換一支吸管。

4.在進(jìn)行連續(xù)稀釋時(shí)，應(yīng)將吸管內(nèi)液體沿壁流入，勿使吸管觸及稀釋液。

5.傾倒?fàn)I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板時(shí)，溫度要在46±1℃之間，數(shù)量要在15ml左右為宜，不要太多太少。

6.培養(yǎng)物48h培養(yǎng)后培養(yǎng)基失重不超過15%，培養(yǎng)箱內(nèi)要放水。

7.樣加入平皿后應(yīng)立即傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，一般從稀釋到傾注不超過20分鐘。

8.平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長時(shí)：菌落之間無明顯界限且僅有一條鏈可視為一個(gè)菌落，如為不同來源的幾條鏈則將每條鏈各做一個(gè)菌落記。

9.做菌落記數(shù)時(shí)平板里所有的菌落都要記數(shù)。

微生物限度檢查法

1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法

1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法

1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法

計(jì)數(shù)方法

……供試品檢查時(shí)，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，檢測的樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。

提示：后文增加了對于“貴重藥品、微量包裝藥品”的檢驗(yàn)量的更的表述，因注意結(jié)合此處的要求。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

……菌液制備……取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加人適量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或……

學(xué)習(xí)：此處改動(dòng)同無菌檢查法，將“3~5ml”的具體量調(diào)整為“適量”，便于根據(jù)孢子的量靈活掌握菌液制備方法。