6分鐘前 湖北PCR實驗室值得信賴「英瀚斯」[英瀚斯2eefa30]內容：ELISA 是一種結合抗原、抗ti特異性反應和酶對底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學實驗技術。ELISA 的基礎是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗ti仍保持其免yi學活性，酶標記的抗原或抗ti既保留其免yi學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗ti或抗原)與固相載體表面的抗原或抗ti起反應，洗滌使固相載體上形成的抗原抗ti復合物與液體中的其他物質分開，再加入酶標記的抗原或抗ti，通過反應使其結合在固相載體上。此時固相上的酶含量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。逆轉錄病毒構建及包裝逆轉錄病毒（Retrovirus）是一類RNA病毒。

動物組織細胞基因組DNA提取

操作步驟

1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另

一離心管中。

2.加2倍體積異，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行）

3.加等量的酚??振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的?，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存備用。

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

miRNA測序

microRNA(miRNA)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關。microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉錄后水平調控蛋白表達（新發現miRNA也能在轉錄水平調控基因表達）。miRNA在物種進化中相當保守，在動物、植物和真菌等中發現的miRNA表達均有嚴格的組織特異性和時序性。miRNA在細胞生長和發育過程中起多種作用，包括調控發育、分化、凋亡和增殖等。以zui小點面積30，平滑度2為主要參數zui大限度檢測蛋白質點。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技術以及第二代測序技術。基于第二代測序技術的miRNA測序，可以一次獲得數百萬條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發育階段、不同疾病狀態下已知和未知的miRNA及其表達差異，為研究miRNA對細胞進程的作用及其生物學影響提供了有力工具。分離培養:將產氣發酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36士1°C培養18-24h，觀察菌落形態。

二、大腸菌群檢驗方法:

由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。 目前國內采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有和原國家商檢局制訂的行業標準。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。5ml離心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，混勻。

(一):采用三步法，即:乳糖發酵試驗、分離培養和證實試驗。乳糖發酵試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發酵管。36士1C培養48土2h，觀察是否產氣。分離培養:將產氣發酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36士1°C培養18-24h，觀察菌落形態。證實試驗:挑取平板上的菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發酵管36士1°C培養24土2h,觀察產氣情況。篩選出差異表達的lncRNA是研究其在人類疾病發生中所扮演角色的基礎。

報告:

根據證實為大腸陽性的管數，查MPN表，報告每100ml ( g)大腸菌群的MPN值。具體操作參見GB4789. 3-94 《中華人民共和國食品衛生微生物學檢驗大腸菌群測定》

(二)原國家商檢局制訂的行業標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸進行檢測。本方法采用兩步法：推測試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36士1C培養48士2h，觀察是否產氣。證實試驗:將產氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36士1°C培養48士2h，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。在逆轉錄病毒載體中，去除了正常的蛋白編碼序列而保留了和包裝信號，通過分子技術將目的基因插入此載體上，而包裝細胞系能提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結構蛋白。具體操作參見SN0169-92《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸檢驗方法》