動物組織細胞基因組DNA提取

操作步驟

1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另

一離心管中。

2.加2倍體積異，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行）

3.加等量的酚??振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的?，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存備用。

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

EMSA實驗

EMSA:凝膠遷移或電泳遷移率檢測是一種檢測蛋白質和DNA序列相結合的技術，初用于研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用，可用于定性和定量分析。分為2種類型：同位素標記探針，非同位素標記探針。

通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚bing烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。舉個例子：miRNA會導致基因沉默現象發生，而如果lncRNA競爭性結合了miRNA，從而影響了miRNA基因沉默功能實現。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段（特異），和其它非相關的片段（非特異），來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據復合物的特點和強度來確定特異結合。

5.長可以合成多長的引物？

答：引物越長，出現問題的概率就越大。目前的研究已證實，lncRNA參與X染色體沉默，基因組印記以及染色質修飾，轉錄ji活，轉錄干擾，核內運輸等多種重要調控過程。有的公司合成過120base的引物，產率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗產品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過40%，后續處理還有丟失很多，的產量很低。

6.需要合成多少OD數？

答：根據實驗目的確定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數。片段越長, 全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數要求，其實也是對社會資源的一種浪費，同時也從一個側面反映了部分研究人員特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復多次才能成功。