分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。lncRNA-Seq可一次性獲得樣本中全部的lncRNAs信息，對lncRNAs的類別、功能進行的深入分析，從而快速準確地獲得與特定生物學過程（例如發育、疾病等）相關lncRNA信息。Sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多。

SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結合時，發出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。雙向電泳分離待測樣品(1)一相等電聚焦前處理按照所用儀器的廠商提供操作手冊進行。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。

實驗流程：細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉錄-定量PCR檢測。

結果示例：

圖 A 基因擴增曲線圖；B 基因擴增溶解曲線圖；C mRNA相對表達量變化

從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果，溶解曲線可以看出引物識別特異性情況，通過使用ΔΔCt方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。

蛋白質定量組學服務

細胞內蛋白質組豐度的動態變化對不同生命過程有重要影響。例如在許多疾病的發生和發展進程中，常常伴隨著某些蛋白質的表達異常。離心后吸上清液400u1移入相應編號的EP管中，再加入400ul異充分混勻。目前定量蛋白質組學技術主要分為標記(label)策略和非標記的(label free)定量策略，其中標記策略又分為體內標記(如 SILAC、15N 標記)，以及體外標記(如 iTRAQ、TMT 標記) 。

傳統的基于2D雙向凝膠電泳分離的蛋白質組通常可以鑒定出約1000種蛋白，對全蛋白質組的覆蓋僅在5~10%左右，不能滿足高通量定量蛋白質表達譜分析的要求。我們結合樣品制備與高分辨率、高靈敏度的液相色譜-質譜聯用技術，可在細胞與組織類樣品中鑒定直至多于10000個蛋白，對全蛋白質組的覆蓋>60%。MiRNA是一類可以通過RNAi機制調節基因表達的內源性小RNA，人工miRNA與shRNA的設計原理基本相同，由于miRNA具有內源性，因此其更易產生有效的基因沉默。結合生物信息學分析，為您構建高通量蛋白質定量表達譜。

25.PCR擴增不出就引物有問題嗎？

答：基本不是。當今發展出各色各樣的PCR擴增技術，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出、擴增效率低的問題。SNP是我們考察遺傳變異的單位,據估計,人類的所有群體中大約存在一千萬個SNP位點。如巢式PCR就是擴增那些拷貝數很低的基因片段。 有些重復片段的擴增, GC含量高的片段，非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。

引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見：

（1） RT-PCR。請注意，很多基因通過常規RT -PCR方法是很難擴增出來的。 RT- PCR成功的關鍵在于RT的反應的RNA質量和目標基因在特定組織和細胞中含量。

（2）從基因組中擴增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴格控制用量。基因組DNA過高，會影響反應體系中的Mg和pH